PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。
PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則包括：
1. 引物長度：
1) 通常在1530個(gè)堿基對(duì)（bp）之間，理想長度為1827bp。
2) 過長的引物可能導(dǎo)致延伸溫度過高，不適合Taq DNA聚合酶的反應(yīng)條件。
2. GC含量：
1) 40%60%之間，以4555%為佳，確保復(fù)性條件最佳。
2) 上下游引物的GC含量和Tm值應(yīng)接近。
3. Tm值：
1) 引物的Tm值應(yīng)在5580℃之間，理想為72℃左右，以保證復(fù)性效率。
2) 正向和反向引物的Tm值相差不超過5℃。
4. 3'端特性：
1) 3'端堿基一般不使用A，因?yàn)?/font>A可能增加錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率。
2) 3'端避免出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基（如GGG或CCC）。
3) 3'端的ΔG值應(yīng)較低，絕對(duì)值不超過9，以減少錯(cuò)配引發(fā)。
5. 引物結(jié)構(gòu)：
1) 避免引物內(nèi)部或兩引物之間的互補(bǔ)，尤其是3'端的互補(bǔ)。
2) 3'端不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，這些結(jié)構(gòu)可能干擾引物與模板的結(jié)合。
3) 引物的ΔG值最好呈正弦曲線，3'端較低，中間和5'端相對(duì)較高。
6. 特異性：
1) 引物不應(yīng)與非特異擴(kuò)增序列有超過70%的同源性，且避免連續(xù)8個(gè)堿基的互補(bǔ)。
2) 引物應(yīng)在核酸保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，并確保引物與模板的特異性。
7. 5'端修飾：
5'端可以修飾以引入限制酶位點(diǎn)、突變位點(diǎn)、標(biāo)記物等。
8. 堿基分布：
1) 引物序列中堿基分布應(yīng)隨機(jī)，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
2) 引物自身不應(yīng)有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)，以免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
9. 產(chǎn)物大小：
特別對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），產(chǎn)物大小通常限制在80250bp之間。
10. 其他注意事項(xiàng)：
1) 避免3'端與模板的多個(gè)位點(diǎn)互補(bǔ)，防止非特異性擴(kuò)增。
2) 在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)考慮引物二聚體的形成，并盡量避免。
3) 對(duì)于RTqPCR，引物應(yīng)設(shè)計(jì)在編碼區(qū)外顯子上，避免內(nèi)含子。
遵循這些原則，可以提高PCR反應(yīng)的效率和特異性，確保實(shí)驗(yàn)的成功。
設(shè)計(jì)引物所要考慮注意事項(xiàng):
1．酶切位點(diǎn)
兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，兩個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)，最好隔四個(gè)核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。
2．酶的選擇
最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。
3．Tm的計(jì)算
Tm是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對(duì)于引物的Tm，只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn)。計(jì)算Tm時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不管5'端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對(duì)于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。
Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計(jì)算公式可以用2+4的公式。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90 ，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29、33個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17、21個(gè)堿基。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的只有50度，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。
其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，有用PP5.0進(jìn)行評(píng)價(jià)的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數(shù)。
4．退火溫度
退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去， PCR幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會(huì)增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。
5．5’端保護(hù)堿基
一般在5'端加保護(hù)堿基,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基
6．引物二聚體
關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對(duì)值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對(duì)值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。
7．引物的設(shè)計(jì)
在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)椋粋€(gè)特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們?cè)谠O(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。
還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5’端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。
設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對(duì)，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A（容易錯(cuò)配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定，目的序列上并不存在的。
